ПЦР анализаторунун көйгөйлөрүн чечүү: Көп берилүүчү суроолор жана чечимдер

Полимераздык чынжыр реакциясы (ПТР) анализаторлору молекулярдык биологиянын маанилүү инструменттери болуп саналат, бул изилдөөчүлөргө генетикалык изилдөөдөн клиникалык диагностикага чейинки колдонмолор үчүн ДНКны көбөйтүүгө мүмкүндүк берет. Бирок, ар кандай татаал түзүлүш сыяктуу, ПЦР анализатору анын иштешине таасир этүүчү көйгөйлөргө туш болушу мүмкүн. Бул макалада кээ бир жалпы суроолор каралатПЦР анализаторукөйгөйлөрдү чечүү жана жалпы көйгөйлөргө практикалык чечимдерди берет.

1. Эмне үчүн менин ПТР реакциям күчөгөн жок?

Колдонуучулар туш болгон эң кеңири таралган көйгөйлөрдүн бири ПЦР реакциясынын максаттуу ДНКны күчөтө албагандыгы. Бул бир нече факторлорго байланыштуу болушу мүмкүн:

Туура эмес праймер дизайны: Сиздин праймериңиз максаттуу ырааттуулук үчүн өзгөчө экенин жана оптималдуу эрүү температурасына (Тм) ээ экендигин текшериңиз. Белгилүү эмес байланышты болтурбоо үчүн праймер дизайны үчүн программалык куралдарды колдонуңуз.

Үлгү ДНКсы жетишсиз: Сиз шаблон ДНКсынын жетиштүү көлөмүн колдонуп жатканыңызды текшериңиз. Өтө аз болсо, алсыз же күчөтүлбөйт.

Үлгүдөгү ингибиторлор: Үлгүдөгү булгоочу заттар ПТР реакциясын токтото алат. ДНКңызды тазалоону же башка экстракция ыкмасын колдонууну карап көрүңүз.

Чечим: Праймердин дизайнын текшериңиз, шаблондун концентрациясын жогорулатыңыз жана үлгүңүздө ингибиторлор жок экенин текшериңиз.

2. Эмне үчүн менин ПТР продуктусу туура эмес өлчөмдө?

Эгерде сиздин ПТР продуктунун өлчөмү күтүлгөндөй болбосо, бул реакция шарттарында же колдонулган ингредиенттерде көйгөй бар экенин көрсөтүп турат.

Спецификалык эмес күчөтүү: Бул праймер күтүлбөгөн сайтка туташканда пайда болушу мүмкүн. Праймерлердин өзгөчөлүгүн BLAST сыяктуу курал менен текшериңиз.

Туура эмес күйгүзүү температурасы: Эгерде күйгүзүү температурасы өтө төмөн болсо, спецификалык эмес байланыш пайда болушу мүмкүн. Градиенттик ПТР аркылуу күйгүзүү температурасын оптималдаштыруу.

Чечим: ПТР продуктуларынын тактыгын жакшыртуу үчүн праймердин өзгөчөлүгүн ырастаңыз жана күйдүрүү температурасын оптималдаштырыңыз.

3. Менин ПТР анализаторум ката билдирүүсүн көрсөтөт. мен эмне кылышым керек?

ПЦР анализаторундагы ката билдирүүлөрү коркунучтуу болушу мүмкүн, бирок алар көп учурда мүмкүн болуучу көйгөйлөргө жардам берет.

Калибрлөө маселелери: ПЦР анализатору туура калибрленгенин текшериңиз. Так натыйжаларды алуу үчүн үзгүлтүксүз тейлөө жана калибрлөө текшерүүлөрү абдан маанилүү.

Программалык камсыздоо тобу: Кээде программалык мүчүлүштүктөр көйгөйлөргө алып келиши мүмкүн. Компьютериңизди өчүрүп күйгүзүңүз жана программалык камсыздоо жаңыртууларын текшериңиз.

ЧЕЧИМ: конкреттүү ката коду үчүн колдонуучунун колдонмосун караңыз жана сунушталган көйгөйлөрдү чечүү кадамдарын аткарыңыз. Үзгүлтүксүз тейлөө көптөгөн көйгөйлөрдүн алдын алат.

4. Эмне үчүн менин ПТР реакциясынын натыйжалары дал келбейт?

ПЦРдин дал келбеген натыйжалары бир нече себептерден улам нааразы болушу мүмкүн:

Реагенттин сапаты: Бардык реагенттер, анын ичинде ферменттер, буферлер жана dNTPs жаңы жана жогорку сапатта экендигин текшериңиз. Мөөнөтү өткөн же булганган реагенттер өзгөрүлмөлүүлүккө алып келиши мүмкүн.

Термикалык циклдерди калибрлөө: Температуранын туура эмес орнотуулары ПТР процессине таасир этиши мүмкүн. Термикалык циклдердин калибрлөөсүн дайыма текшерип туруңуз.

Чечим: Натыйжаларды ырааттуу камсыз кылуу үчүн жогорку сапаттагы реагенттерди колдонуңуз жана термикалык циклиңизди үзгүлтүксүз калибрлеп туруңуз.

5. ПЦР реакциясынын эффективдүүлүгүн кантип жогорулатуу керек?

ПЦР реакцияларынын эффективдүүлүгүн жогорулатуу жогорку түшүмгө жана ишенимдүү натыйжаларга алып келиши мүмкүн.

Реакция шарттарын оптималдаштыруу: Праймерлердин, шаблон ДНКсынын жана MgCl2нин ар кандай концентрациясын колдонуу менен эксперимент. Ар бир ПТР реакциясы оптималдуу иштеши үчүн уникалдуу шарттарды талап кылышы мүмкүн.

Жогорку тактыктагы ферменттерди колдонуңуз: Эгер тактык өтө маанилүү болсо, күчөтүү учурунда каталарды азайтуу үчүн жогорку тактыктагы ДНК полимеразаны колдонууну карап көрүңүз.

Чечим: Сиздин конкреттүү ПТР орнотууңуз үчүн эң жакшы шарттарды табуу үчүн оптималдаштыруу экспериментин жасаңыз.

Кыскача айтканда

Көйгөйлөрдү чечүү аПЦР анализаторутатаал иш болушу мүмкүн, бирок жалпы көйгөйлөрдү жана алардын чечимдерин түшүнүү сиздин ПТР тажрыйбаңызды бир топ жакшыртат. Бул жалпы көйгөйлөрдү чечүү менен, изилдөөчүлөр ПТР жыйынтыктарын жакшыртуу жана молекулярдык биология колдонмолордо ишенимдүү натыйжаларды камсыз кыла алат. Үзгүлтүксүз тейлөө, реагенттерди кылдат тандоо жана реакция шарттарын оптималдаштыруу ийгиликтүү ПТР анализинин ачкычы болуп саналат.