ПЦР реакцияларындагы интерференция факторлору

ПЦР реакциясы учурунда кээ бир тоскоолдук кылуучу факторлор көп кездешет.
ПЦРдин өтө жогорку сезгичтигинен улам, булгануу ПЦР жыйынтыктарына таасир этүүчү эң маанилүү факторлордун бири болуп эсептелет жана жалган оң натыйжаларды бериши мүмкүн.
Жалган терс натыйжаларга алып келүүчү ар кандай булактар ​​да бирдей маанилүү. Эгерде ПЦР аралашмасынын бир же бир нече маанилүү бөлүгү же күчөтүү реакциясынын өзү басылса же кийлигишсе, диагностикалык анализге тоскоол болушу мүмкүн. Бул натыйжалуулуктун төмөндөшүнө жана ал тургай жалган терс натыйжаларга алып келиши мүмкүн.
Ингибирлөөдөн тышкары, үлгү даярдоого чейинки жеткирүү жана/же сактоо шарттарынан улам максаттуу нуклеин кислотасынын бүтүндүгүнүн жоголушу мүмкүн. Атап айтканда, жогорку температура же жетишсиз сактоо клеткалардын жана нуклеин кислоталарынын бузулушуна алып келиши мүмкүн. Клеткалардын жана ткандардын фиксациясы жана парафиндин кошулушу ДНКнын фрагментациясынын белгилүү себептери жана туруктуу көйгөй болуп саналат (1 жана 2-сүрөттөрдү караңыз). Мындай учурларда, ал тургай оптималдуу изоляция жана тазалоо да жардам бербейт.

1-сүрөт | Иммобилизациянын ДНКнын бүтүндүгүнө тийгизген таасири
Агароз гелинин электрофорези аутопсиянын парафин кесимдеринен бөлүнүп алынган ДНКнын сапаты бир топ айырмаланарын көрсөттү. Фиксациялоо ыкмасына жараша экстракттарда ар кандай орточо фрагмент узундугундагы ДНК болгон. ДНК табигый тоңдурулган үлгүлөрдө жана буферленген нейтралдуу формалинде фиксацияланганда гана сакталган. Күчтүү кислоталуу Буэн фиксаторун же буферленбеген, кумурска кислотасын камтыган формалинди колдонуу ДНКнын олуттуу жоголушуна алып келген. Калган фракция өтө фрагменттелген.
Сол жакта, фрагменттердин узундугу килобаза жуптарында (кбп) көрсөтүлөт.

2-сүрөт | Нуклеин кислотасынын буталарынын бүтүндүгүнүн жоголушу
(а) Эки жиптеги 3′-5′ аралык максаттуу ДНКнын үзүлүшүнө алып келет. ДНКнын синтези кичинекей фрагментте дагы эле жүрө берет. Бирок, эгерде ДНК фрагментинде праймердин күйгүзүүчү жери жок болсо, анда сызыктуу амплификация гана болот. Эң жагымдуу учурда, фрагменттер бири-бирин кайрадан каныктырышы мүмкүн, бирок түшүмдүүлүк аз жана аныктоо деңгээлинен төмөн болот.
(b) Негизинен депуринация жана тимидин димеринин пайда болушунан улам негиздер жоголушу Н-байланыштарынын санынын азайышына жана Tmдин азайышына алып келет. Узак жылуу фазасында праймерлер матрицалык ДНКдан эрип кетет жана анча катаал эмес шарттарда да күйбөйт.
(c) Жанаша жайгашкан тимин негиздери TT димерин түзөт.
Молекулярдык диагностикада көп кездешкен дагы бир кеңири таралган көйгөй - бул фенол-хлороформ экстракциясына салыштырмалуу максаттуу нуклеин кислоталарынын оптималдуу эмес бөлүнүп чыгышы. Өзгөчө учурларда, бул жалган терс натыйжалар менен байланыштуу болушу мүмкүн. Кайнатуу лизиси же клетка калдыктарын ферменттик сиңирүү менен көп убакытты үнөмдөөгө болот, бирок бул ыкма көбүнчө нуклеин кислотасынын жетишсиз бөлүнүп чыгышынан улам ПЦР сезгичтигинин төмөндүгүнө алып келет.

Амплификация учурунда полимеразанын активдүүлүгүнүн ингибирлениши

Жалпысынан алганда, ингибирлөө ПЦРдин субоптималдуу натыйжаларына алып келүүчү бардык факторлорду сүрөттөө үчүн контейнер түшүнүгү катары колдонулат. Так биохимиялык мааниде, ингибирлөө ферменттин активдүүлүгү менен гана чектелет, б.а., ал ДНК полимеразасынын активдүү борбору же анын кофактору (мисалы, Taq ДНК полимеразасы үчүн Mg2+) менен өз ара аракеттенүү аркылуу субстрат-продукттун конверсиясын азайтат же алдын алат.
Үлгүдөгү компоненттер же реагенттерди камтыган ар кандай буферлер жана экстракттар ферментти түздөн-түз ингибирлеп ​​же анын кофакторлорун (мисалы, ЭДТА) кармап, ошону менен полимеразаны активдештирип, өз кезегинде ПЦР натыйжаларынын төмөндөшүнө же жалган терс натыйжаларга алып келиши мүмкүн.
Бирок, реакция компоненттери менен максаттуу нуклеин кислоталарынын ортосундагы көптөгөн өз ара аракеттенүүлөр "ПЦР ингибиторлору" деп да аталат. Клетканын бүтүндүгү изоляция менен бузулуп, нуклеин кислотасы бөлүнүп чыккандан кийин, үлгү менен аны курчап турган эритменин жана катуу фазанын ортосунда өз ара аракеттенүүлөр пайда болушу мүмкүн. Мисалы, "таштанды чогултуучулар" коваленттик эмес өз ара аракеттенүүлөр аркылуу бир же эки тизмектүү ДНКны байланыштырып, акыры ПЦР реакция идишине жеткен максаттуу топтордун санын азайтуу менен изоляцияга жана тазалоого тоскоол боло алышат.
Жалпысынан алганда, ПЦР ингибиторлору клиникалык диагностикалык тесттер үчүн колдонулган көпчүлүк дене суюктуктарында жана реагенттерде (заарадагы мочевина, кандагы гемоглобин жана гепарин), тамак-аш кошулмаларында (органикалык компоненттер, гликоген, май, Ca2+ иондору) жана айлана-чөйрөдөгү компоненттерде (фенолдор, оор металлдар) кездешет.

Көбүрөөк таралган ПЦР ингибиторлорун бактериялардан жана эукариоттук клеткалардан, максаттуу эмес ДНКдан, ткандардын матрицаларынын ДНК менен байланыштыруучу макромолекулаларынан жана кол каптар жана пластмассалар сыяктуу лабораториялык жабдуулардан тапса болот. Экстракция учурунда же андан кийин нуклеин кислоталарын тазалоо ПЦР ингибиторлорун алып салуунун артыкчылыктуу ыкмасы болуп саналат.
Бүгүнкү күндө ар кандай автоматташтырылган экстракция жабдуулары көптөгөн кол менен башкарылуучу протоколдорду алмаштыра алат, бирок буталарды 100% калыбына келтирүү жана/же тазалоо эч качан ишке ашырылган эмес. Тазаланган нуклеин кислоталарында потенциалдуу ингибиторлор дагы эле болушу мүмкүн же буга чейин күчүнө кирген болушу мүмкүн. Ингибиторлордун таасирин азайтуу үчүн ар кандай стратегиялар бар. Тийиштүү полимеразаны тандоо ингибитордун активдүүлүгүнө олуттуу таасир этиши мүмкүн. ПЦР ингибирлөөсүн азайтуунун башка далилденген ыкмалары - полимеразанын концентрациясын жогорулатуу же BSA сыяктуу кошумчаларды колдонуу.
ПТР реакцияларынын ингибирленишин ички процесстин сапатын көзөмөлдөө (ИПК) ыкмасын колдонуу менен көрсөтсө болот.
Нуклеин кислотасынын изолятынан этанол, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, изопропанол жана фенол сыяктуу бардык реагенттерди жана экстракциялык комплекттеги башка эритмелерди кылдат жууп салуу кадамы менен алып салуу керек. Алардын концентрациясына жараша, алар ПЦРди активдештириши же ингибирлеши мүмкүн.