ПЦР реакцияларындагы интерференциялык факторлор

ПЦР реакциясы учурунда кээ бир тоскоолдук кылуучу факторлор көп кездешет.
ПТРдин өтө жогорку сезгичтигинен улам, булгануу ПТР натыйжаларына таасир этүүчү эң маанилүү факторлордун бири болуп эсептелет жана жалган оң натыйжаларды бериши мүмкүн.
Жалган-терс натыйжаларга алып келген ар кандай булактар ​​да бирдей сын. Эгерде ПТР аралашмасынын бир же бир нече маанилүү бөлүктөрү же күчөтүү реакциясынын өзү бөгөт коюлса же тоскоолдук кылса, диагностикалык анализге тоскоол болушу мүмкүн. Бул натыйжалуулуктун төмөндөшүнө, ал тургай, жалган терс натыйжаларга алып келиши мүмкүн.
Тоскоолдуктан тышкары, нуклеиндик кислотанын максаттуу бүтүндүгүнүн жоголушу үлгү даярдоого чейин жеткирүү жана/же сактоо шарттарына байланыштуу болушу мүмкүн. Атап айтканда, жогорку температура же жетишсиз сактоо клеткалардын жана нуклеиндик кислоталардын бузулушуна алып келиши мүмкүн. Клетканын жана ткандардын фиксациясы жана парафиндин орнотулушу ДНКнын фрагментациясынын белгилүү себептери жана туруктуу көйгөй (1 жана 2-сүрөттөрдү караңыз). Мындай учурларда, ал тургай, оптималдуу изоляция жана тазалоо жардам бербейт.

1-сүрөт | Иммобилизациянын ДНКнын бүтүндүгүнө тийгизген таасири
Агароздук гел электрофорези аутопсиялардын парафиндик бөлүмдөрүнөн бөлүнүп алынган ДНКнын сапаты бир топ ар түрдүү экендигин көрсөттү. Фиксация ыкмасына жараша экстракттарда ар кандай орточо узундуктагы ДНКлар болгон. ДНК жергиликтүү тоңдурулган үлгүлөргө жана буфердик нейтралдуу формалинге бекитилгенде гана сакталган. Күчтүү кислоталуу Буин фиксаторун же буферсиз, кумурска кислотасын камтыган формалинди колдонуу ДНКнын олуттуу жоголушуна алып келди. Калган фракция өтө майдаланган.
Сол жакта фрагменттердин узундугу килобаза жуптары менен көрсөтүлөт (kbp)

2-сүрөт | Нуклеин кислотасынын бутактарынын бүтүндүгүн жоготуу
(а) Эки жиптеги 3′-5′ боштук максаттуу ДНКнын үзүлүшүнө алып келет. ДНКнын синтези дагы эле кичинекей фрагментте болот. Бирок, эгерде ДНК фрагментинде праймерди күйгүзүүчү жер жок болсо, анда сызыктуу күчөтүү гана пайда болот. Эң жагымдуу учурда, фрагменттер бири-бирин кайра толтурушу мүмкүн, бирок түшүмдүүлүк кичинекей жана аныктоо деңгээлинен төмөн болот.
б) Негизинен депуринденүү жана тимидиндик димердин пайда болушуна байланыштуу негиздердин жоголушу Н- байланыштарынын санынын азайышына жана Тм азайышына алып келет. Узакка созулган жылытуу фазасында праймерлер матрицалык ДНКдан эрип кетишет жана азыраак катаал шарттарда да күйбөйт.
(c) Тиминдик негиздер ТТ димерди түзөт.
Молекулярдык диагностикада көп кездешүүчү дагы бир жалпы көйгөй фенол-хлороформ экстракциясына салыштырмалуу максаттуу нуклеиндик кислоталардын оптималдуу эмес чыгарылышы болуп саналат. Өзгөчө учурларда, бул жалган негативдер менен байланыштуу болушу мүмкүн. Клетка калдыктарын кайнатуу лизиси же ферменттик сиңирүү жолу менен көп убакытты үнөмдөөгө болот, бирок бул ыкма көп учурда нуклеиндик кислотанын жетишсиздигинен улам төмөн ПЦР сезгичтигине алып келет.

Күчөтүү учурунда полимераздын активдүүлүгүн токтотуу

Жалпысынан алганда, бөгөт коюу субоптималдуу ПТР натыйжаларына алып келген бардык факторлорду сүрөттөө үчүн контейнер түшүнүгү катары колдонулат. Катуу биохимиялык мааниде, ингибирлөө ферменттин активдүүлүгү менен чектелет, башкача айтканда, ДНК полимеразасынын активдүү чөйрөсү же анын кофактору (мисалы, Так ДНК полимеразасы үчүн Mg2+) менен өз ара аракеттенүү аркылуу субстрат-продукциянын өзгөрүшүн азайтат же алдын алат.
Үлгүдөгү компоненттер же реагенттерди камтыган ар кандай буферлер жана экстракттар ферментти түздөн-түз бөгөттөп же анын кофакторлорун (мисалы, EDTA) кармап калышы мүмкүн, ошону менен полимеразаны инактивациялоо жана өз кезегинде ПТРдин төмөндөшүнө же жалган терс натыйжаларга алып келет.
Бирок, реакция компоненттеринин жана максаттуу камтыган нуклеиндик кислоталардын ортосундагы көптөгөн өз ара аракеттенүүлөр да "ПЦР ингибиторлору" деп аталат. Клетканын бүтүндүгү обочолонуу менен бузулуп, нуклеин кислотасы бөлүнүп чыккандан кийин үлгү менен анын курчап турган эритмеси менен катуу фазанын ортосунда өз ара аракеттешүү пайда болушу мүмкүн. Мисалы, "тазалоочулар" коваленттүү эмес өз ара аракеттешүү аркылуу бир же эки тилкелүү ДНКны байланыштыра алышат жана акырында ПЦР реакциясынын идишине жетүүчү буталардын санын азайтып, изоляцияга жана тазалоого тоскоолдук кылышы мүмкүн.
Жалпысынан алганда, ПЦР ингибиторлору көпчүлүк организм суюктуктарында жана клиникалык диагностикалык тесттер үчүн колдонулган реагенттерде (заарадагы мочевина, гемоглобин жана кандагы гепарин), тамак-аш кошулмаларында (органикалык компоненттер, гликоген, май, Са2+ иондору) жана чөйрөдөгү компоненттерде (фенолдордо) бар. , оор металлдар)

Көбүрөөк таралган ПТР ингибиторлору бактериялар менен эукариоттук клеткаларда, максаттуу эмес ДНКда, ткань матрицаларынын ДНК-байланыштуу макромолекулаларында жана мээлейлер жана пластмассалар сыяктуу лабораториялык жабдуулардан тапса болот. Экстракция учурунда же андан кийин нуклеиндик кислоталарды тазалоо ПЦР ингибиторлорун алып салуу үчүн артыкчылыктуу ыкма болуп саналат.
Бүгүнкү күндө ар кандай автоматташтырылган казып алуу жабдуулары көптөгөн кол протоколдорду алмаштыра алат, бирок 100% калыбына келтирүү жана/же максаттарды тазалоо эч качан ишке ашкан эмес. Потенциалдуу ингибиторлор тазаланган нуклеиндик кислоталарда дагы эле болушу мүмкүн же буга чейин эле күчүнө кирген болушу мүмкүн. Ингибиторлордун таасирин азайтуу үчүн ар кандай стратегиялар бар. Тиешелүү полимеразаны тандоо ингибиторунун активдүүлүгүнө олуттуу таасирин тийгизиши мүмкүн. ПТРдин бөгөт коюусун азайтуунун башка далилденген ыкмалары полимераз концентрациясын жогорулатуу же BSA сыяктуу кошумчаларды колдонуу.
ПТР реакцияларынын бөгөт коюу процессинин сапатын ички контролдоону (IPC) колдонуу менен көрсөтсө болот.
Этанол, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, изопропанол жана фенол сыяктуу экстракциялоо комплектиндеги бардык реагенттерди жана башка эритмелерди нуклеин кислотасынын изолятын кылдат жууп салуу менен алып салууга кам көрүү керек. Алардын концентрациясына жараша алар ПТРди активдештирип же бөгөттөп коюшу мүмкүн.